Мутация Янус-киназы 2 JAK2 Val617Phe
Стоимость анализа
стоимость указана без учета стоимости забора биологического материала
Добавить в корзину
Готовность результатов анализа
Обычные*: 8-12 р.д.
Дата сдачи анализа:
Дата готовности:
*не считая дня сдачи.
Где и когда можно сдать
Подготовка к анализу
Подготовка не требуется.
Забор биоматериала
Методы выполнения и тесты
Файлы
Для чего это нужно
Миелопролиферативные заболевания (МПЗ, хронические миелоидные опухоли) – группа заболеваний, характеризующихся избыточной пролиферацией одного или нескольких ростков кроветворения. Это группа Ph-негативных хронических лейкозов, обусловленных нарушениями на уровне гемопоэтических стволовых клеток. К самым распространенным заболеваниям этой группы относятся истинная полицитемия (эритремия), эссенциальная тромбоцитемия и первичный (идиопатический) миелофиброз. Частота встречаемости этих заболеваний составляет от 1 до 2,3 на 100 тыс. населения.
Истинная полицитемия характеризуется возрастанием количества циркулирующих эритроцитов (6–8 х 10 12 /л), в меньшей степени нейтрофилов и тромбоцитов, повышением гематокрита и спленомегалией (увеличение размеров селезенки).
Эссенциальная тромбоцитемия характеризуется увеличением количества тромбоцитов (> 450 x 10 9 /л), нарушением агрегационной способности тромбоцитов, развитием внутрисосудистого свертывания крови.
Первичный миелофиброз характеризуется фиброзом костного мозга, экстрамедуллярным гемопоэзом и спленомегалией.
В развитии хронических миелоидных опухолей выявлено более 20 соматических мутаций, из которых мутация JAK 2 Val617Phe в 14 экзоне локуса 9q24 гена янус-киназы 2 является наиболее распространенной. Она обнаруживается в 96% случаев у пациентов с истинной полицитемией, в 55% случаев при эссенциальной тромбоцитопении и примерно в 45-68% случаев при первичном миелофиброзе. Однако мутация может встречаться и при острой миелоидной лейкемии, миелодиспластическом синдроме, хронической миеломоноцитарной лейкемии. Мутация не передается по наследству. Частота встречаемости в мире составляет 4 на 10 тыс. человек.
Янус-киназа 2 (JAK 2) – это цитоплазматическая тирозинкиназа, которая является промежуточным звеном в JAK-STAT сигнальном пути, приводящему к активации генов посредством транскрипции. Замена в 1849-м положении G на T в гене янус киназы 2 приводит к замене валина (Val, V) на фенилаланин (Phe, F) в положении 617, итогом которой является изменение структуры белка и повышение его активности, приводя к активации пролиферации клетки и накоплению клеток зрелого миелоидного ряда.
Согласно ВОЗ (2015г.) наличие мутации является одним из диагностических критериев для постановки диагноза хронических миелоидных опухолей. Своевременное обнаружение мутации JAK 2 V617F позволяет назначить эффективную терапию для предотвращения развития миелопролиферативного заболевания и его осложнений.
Одним из основных осложнений таких заболеваний является тромбофилия, которая характеризуется предрасположенностью к тромбозам у пациента, и тем самым повышая риск антенатальной гибели плода во время беременности. Для исключения повышения риска тромбозов рекомендуется также провести обследование на наличие аутоиммунных антител (антифосфолипидный синдром) и генетические анализы на тромбофилию. Наличие МПЗ нередко служит фактором риска развития синдрома Бадда-Киари, поэтому для исключения гематологического заболевания назначают анализ на выявление мутации JAK 2 V617F. В некоторых исследованиях также отмечается связь данной мутации с уровнем липопротеинов высокой плотности, низкой плотности и общего холестерина. Однако корреляция еще не до конца изучена.
Анализ на выявление мутации JAK2 V617F имеет диагностическое значение и показан для:
Мутация jak2 v617f 17 аллельная нагрузка что это значит
Поиск
Выявление мутации Jak2 V617F при хронических Ph-негативных заболеваниях
А.М. САВРИЛОВА¹, А.В. КОСТЕРИНА², А.Р. АХМАДЕЕВ¹
¹Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, Оренбургский Тракт, д. 138
²Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Саврилова Алсу Мухарямовна — врач-гематолог консультативной поликлиники, тел. +7-905-312-63-09, e-mail: а[email protected] 1
Костерина Анна Валентиновна — ассистент кафедры госпитальной терапии, тел. +7-917-273-77-68, e-mail: [email protected] 2
Ахмадеев Арслан Радикович — заведующий отделением гематологии, тел. +7-927-240-55-90, e-mail: [email protected] 1
Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) — это клональные заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения. К частым миелопролиферативным заболеваниям относятся истинная полицитемия, (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ). Были выявлены специфические молекулярные аномалии, характерные для этих заболеваний. Наиболее часто встречаемая — мутация гена Янус-киназы 2 (Jak2 V617F).
Ключевые слова: хронические миелопролиферативные заболевания, истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз, мутация Jak2 V617F.
A.M. SAVRILOVA¹, A.V. KOSTERINA², A.R. AKHMADEYEV¹
¹Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation 420012
²Republic Clinical Hospital of the Ministry of Healthcare of the Republic of Tatarstan, 138 Orenburgskiy Trakt, Kazan, Russian Federation 420064
Revealing of Jak2 V617F mutation in chronic Ph-negative diseases
Savrilova A.M. — doctor-hematologist of Consultative Outpatient Policlinic, tel. +7-905-312-63-09, e-mail: а[email protected] 1
Kosterina A.V. — Assistant Lecturer of Hospital Therapy Department, tel. +7-917-273-77-68, e-mail: [email protected] 2
Akhmadeyev A.R. — Head of Hematology Department, tel. +7-927-240-55-90,
Chronic myeloproliferative diseases (CMPD) are clonal disorders with excess proliferation (cell production) of one or more lineages of hematopoiesis. The most common CMPDs are polycythemia vera, essential thrombocytosis and idiopathic primary myelofibrosis. Specific molecular abnormalities were found that are characteristic for these disorders. The most common of them is mutation of gene Janus kinase 2 (Jak2 V617F).
Key words: chronic myeloproliferative diseases, polycythemia vera, essential thrombocytosis, idiopathic primary myelofibrosis, mutation Jak2 V617F.
Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) — это заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения, включающие несколько клональных Ph-негативных гематологических болезней. К частым миелопролиферативным заболеваниям относятся истинная полицитемия, (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ) [1]. Их происхождение связано с трансформацией гемопоэтической стволовой клетки, результатом чего служит чрезмерная продукция зрелых клеток эритроидного, мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков с относительно продолжительным течением заболевания.
Последние 5 лет ознаменовались фундаментальными успехами в понимании патогенеза этих болезней. Была выявлена специфическая для этих заболеваний молекулярная аномалия — приобретенная точечная мутация гена Янус-киназы 2 (Jak2 V617F), обнаруживаемая при ИП, ЭТ и ПМФ [2]. Данная мутация была открыта у большинства пациентов с ИП и у 50-60 % пациентов с ЭТ и ПМФ (табл. 1).
Таблица 1. Молекулярные аномалии, связанные с «классическими» миелопролиферативными заболеваниями
| Генетическая аномалия | Нозология | Частота, % | |||
| Jak2 V617F | Истинная полицитемия | > 95 | |||
| Эссенциальная тромбоцитемия | 50-70 | ||||
| Первичный миелофиброз | 40-50 | ||||
Все члены семейства Янус-киназ (JAK1, JAK2, JAK3) и тирозинкиназа 2 (Tyk2) имеют активный киназный домен JH1 и сходный по строению домен JH2, осуществляющий функцию подавления активности киназы. Наличие двух сходных по строению, но противоположных по функции доменов в одной тирозинкиназе напоминает римского бога двуликого Януса, который смотрел одновременно в двух направлениях. Это послужило поводом для обозначения этих тирозинкиназ как Янус-киназ. Функция белков JAK заключается в том, что они служат промежуточным звеном между рецепторами на мембране клетки и сигнальными молекулами. Когда определенные цитокины или факторы роста (эритропоэтин (ЭПО), тромбопоэтин (TПO), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), интерферон-γ (ИФН-γ) и др.) связываются с рецепторами JAK-киназ на поверхности клетки, JAK-киназы активируются (фосфорилируются). Далее происходит последовательное фосфорилирование (активирование) белков семейства STAT (передатчик сигнала и активатор транскрипции). Активация путей JAK2 также приводит к активации сигнальных путей с участием митоген-активированного протеина (МАР-киназы), фосфатидилинозитол-3-киназы АКТ (PI3K-AKT), которые передают сигналы для выживания, пролиферации и дифференцировки эритробластных предшественников.
При появлении мутации Jak2 (V617F или в экзоне 12) эти сигналы активируются автономно, независимо от связывания цитокина со своим рецептором [3, 4].
Открытие мутации Jak2 V617F значительно улучшает наше понимание патогенеза ИП, ЭТ и ПМФ, но этиология ЭТ и ПМФ без мутации Jak2 V617F остается неясной. Известно, что большинство пациентов с ЭТ и ПМФ без мутации Jak2 V617F имеют, тем не менее, клональный гранулоцитопоэз.[5]
Среди «классических» ХМПЗ ИП и ЭТ — относительно безобидные болезни, которые приводят к небольшому сокращению продолжительности жизни по сравнению с контрольной популяцией. Однако у большинства пациентов в течение болезни возникает связанное с ней то или иное тяжелое и опасное осложнение. И, наоборот, ПМФ в большинстве случаев имеет тяжелое течение со значительно укороченным сроком выживания. У трех рассматриваемых клинических единиц есть несколько общих свойств, например: происхождение из мультипотентной гемопоэтической стволовой клетки, относительно нормальное созревание клеток и значительное сходство клинических проявлений. ПМФ может иметь собственные особые проявления, а для ИП и ЭТ характерна эволюция в постполицитемический и посттромбоцитемический миелофиброз (или реже один в другой) и способность заканчиваться острым миелобластным лейкозом [6].
Опубликовано предложение пересмотреть диагностические критерии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по ХМПЗ [7]. Присутствие мутации Jak2 V617F или других мутаций Jak2, включая мутации в экзоне 12, теперь рассматриваются как главные критерии для диагноза ХМПЗ. Сейчас молекулярное исследование входит в диагностические критерии ВОЗ 2008 г. [1], а тесты на наличие мутаций Jak2 стали стандартным методом диагностики ХМПЗ [8, 9]. Показано, что выявление одной из этих мутаций, несомненно, устанавливает наличие клонального ХМПЗ и исключает возможность реактивного эритроцитоза, тромбоцитоза или миелофиброза. К сожалению, они не помогают дифференцировать разные формы ХМПЗ (табл. 2).
Таблица 2.
Диагностические критерии ВОЗ для ХМПЗ (2008)
Hb или Ht >99% референтного значения по возрасту, полу или высоте проживания или
Hb >170 г/л (муж.) или >150 г/л (жен.) при одновременном повышении уровня Hb на ≥20 г/л от исходного уровня без терапевтической коррекции дефицита железа или
Повышенная масса эритроцитов ≥25% среднего нормального значения.
За период с ноября 2013 по апрель 2014 г. в ГАУЗ «РКБ» МЗ РТ нами было проведено 46 исследований на Jak-2 мутацию пациентов с подозрением на ХМПЗ. Средний возраст больных — 52± 25 лет. Мужчины — 17 человек, женщины — 29 человек. В 37 случаях Jak-2 мутация была обнаружена.
Диагноз истинной полицитемии был установлен у 29 человек, первичного миелофиброза — 3 человека, эссенциальная тромбоцитемия — 5 человек.
Из всех пациентов троим была проведена спленэктомия за несколько лет до установки диагноза вследствие развития тромбоза селезеночной вены.
В настоящее время исследование на наличие мутации Jak2 V617F необходимое условие для установления правильного диагноза и определения дальнейшей тактики ведения пациента.
1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point-of care diagnostic algotryms // Leukemia. — 2008. — Vol. 22. — Р. 14-22.
2. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of JAK2: Dameshek’s 54 year old speculation comes of age // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2007. — 20. — Р. 5-12.
3. Saharinen P., Silvennoinen O. The pseudokinase domain is required for suppression of basal activity of Jak2 and Jak3 tyrosine kinases and for cytokine-inducible activation of signal transduction // J. Biol. Chem. — 2002. — 277. — Р. 47954-63.
4. Feener E.P., Rosario F., Dunn S.L., Stancheva Z., Myers M.G. Jr. Tyrosine phosphorylation of Jak2 in the JH2 domain inhibits cytokine signaling // Mol. Cell Biol. — 2004. — 24. — Р. 4968-78.
5. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders // Blood. — 2007. — 111. — Р. 1686-9.
6. Tefferi A., Gangat N., Wolanskyj A.P. et al. 20 yr without leukemic or fibrotic transformation in essential thrombocythemia or polycythemia vera: predictors at diagnosis // Eur. J. Haematol. — 2008. — 80. — Р. 386-90.
7. Spivak J.L., Silver R.T. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis, and primary myelofibrosis: an alternative proposal // Blood. — 2008. — 112. — Р. 231-9.
8. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. (eds.) WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues, 4th edn // Lyon: IARC-press, 2008.
9. Tefferi A., Vardiman J.W. The diagnostic interface between histology and molecular tests in myeloproliferative disorders // Curr. Opin. Hematol. — 2007. — 14. — Р. 115-22.
10. Harrison C.N., Green A.R. Essential thrombocythaemia // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2006. — 19. — Р. 439-53.
11. Kiladjian J.J., Cervantes F., Leebeek F.W. et al. The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis: a report on 241 cases // Blood. — 2008. — 111. — Р. 4922-9.
12. Primignani M., Barosi G., Bergamaschi G. et al. Role of the JAK2 mutation in the diagnosis of chronic myeloproliferative disorders in splanchnic vein thrombosis // Hepatology. — 2006. — 44. — Р. 1528-34.
1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point-of care diagnostic algotrym. Leukemia, 2008, vol. 22, pp. 14-22.
2. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of JAK2: Dameshek’s 54 year old speculation comes of age. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2007, 20, pp. 5-12.
3. Saharinen P., Silvennoinen O. The pseudokinase domain is required for suppression of basal activity of Jak2 and Jak3 tyrosine kinases and for cytokine-inducible activation of signal transduction. J. Biol. Chem., 2002, 277, pp. 47954-63.
4. Feener E.P., Rosario F., Dunn S.L., Stancheva Z., Myers M.G. Jr. Tyrosine phosphorylation of Jak2 in the JH2 domain inhibits cytokine signaling. Mol. Cell Biol., 2004, 24, pp. 4968-78.
5. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood, 2007, 111, pp. 1686-9.
6. Tefferi A., Gangat N., Wolanskyj A.P. et al. 20 yr without leukemic or fibrotic transformation in essential thrombocythemia or polycythemia vera: predictors at diagnosis. Eur. J. Haematol., 2008, 80, pp. 386-90.
7. Spivak J.L., Silver R.T. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis, and primary myelofibrosis: an alternative proposal. Blood, 2008, 112, pp. 231-9.
8. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. (eds.) WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues, 4th edn. Lyon: IARC-press, 2008.
9. Tefferi A., Vardiman J.W. The diagnostic interface between histology and molecular tests in myeloproliferative disorders. Curr. Opin. Hematol., 2007, 14, pp. 115-22.
10. Harrison C.N., Green A.R. Essential thrombocythaemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19, pp. 439-53.
11. Kiladjian J.J., Cervantes F., Leebeek F.W. et al. The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis: a report on 241 cases. Blood, 2008, 111, pp. 4922-9.
12. Primignani M., Barosi G., Bergamaschi G. et al. Role of the JAK2 mutation in the diagnosis of chronic myeloproliferative disorders in splanchnic vein thrombosis. Hepatology, 2006, 44, pp. 1528-34.
Определение мутации V617F в 14 экзоне гене Jak 2 киназы качественно
Определение мутации гена, контролирующего кроветворение (JAK 2), представляет собой генетический метод исследования. Анализ назначается для выявления риска развития тромбозов и формирования миелопролиферативных заболеваний. В результате изучения генома обнаруживают мутационные изменения, устанавливают повышенную активность свертывающей способности крови вследствие нарушения физиологической активности янус киназы 2. Основываясь на результатах обследования, проводят профилактические мероприятия, предупреждающие развитие патологии.
Показания для проведения анализа
Миелопролиферативные заболевания представляют собой патологический процесс, связанный с повышенной активностью того или иного ростка кроветворения. Изменения возникают на уровне стволовых клеток, вследствие чего развиваются такие болезни, как хронический миелолейкоз, сублейкемический миелоз, тромбоцитемия, эритремия, истинная полицитемия (болезнь Вакеза). Мутации гена, кодирующего янус киназу 2, приводят к усилению функциональной активности вещества и присоединению к нему молекул STAT-белков. Это вызывает повышение индукции транскрипции генов, расщеплению ядра, усиленному делению предшественников клеток крови.
Обследование назначается в следующих случаях:
Все миелопролиферативные заболевания обуславливают высокую вероятность развития тромбозов венечных аретрий, мезентериальных сосудов, вен головного мозга
Диагностика Ph-негативных хронических миелопролиферативных заболеваний. Мутация Янус-киназы 2 JAK2 Val617Phe (количественный анализ) в Краснодаре
Исследование направлено на выявление основной генетической мутации Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний. На основании результата лечащий врач может оценить прогноз заболевания, эффективность предшествующей терапии и выбрать/изменить план лечения.
Приём и исследование биоматериала
Когда нужно сдавать анализ Диагностика Ph-негативных хронических миелопролиферативных заболеваний. Мутация Янус-киназы 2 JAK2 Val617Phe (количественный анализ)?
Подробное описание исследования
Миелопролиферативные заболевания (МПЗ) — это группа классических хронических лейкозов, которые развиваются в результате соматической мутации кроветворной клетки в миелоидной ткани. Мутировавшая клетка начинается бесконтрольно размножаться, её дочерние клетки дифференцируются по всем росткам кроветворения. Это свойство отражается в изменении показателей эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в анализах крови.
К миелопрофилеративным заболеваниям относят следующие онкогематологические патологии:
В клинической практике все вышеуказанные нозологии подразделяют на те, которые имеют филадельфийскую хромосому (Ph+) и на те, которые её не имеют (Ph-). Филадельфийская хромосома (Ph) — это цитогенетическая мутация, развивающаяся при взаимном переносе генетического материала между 9-й и 22-й хромосомами. Этот обмен приводит к патологическому удлинению 9-й хромосомы и укорочению 22-й хромосомы. Филадельфийская хромосома — это обозначение укороченной хромосомы из 22-й пары.
Ph-хромосома способствует развитию подавляющего количества миелопролиферативных заболеваний (порядка 95 %). Остальные 5 % МПЗ относятся к т.н. Ph-негативным заболеваниям, в их число входят: истинная полицитемия (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ), первичный миелофиброз (ПМФ). Данное лабораторное исследование является одним из методов диагностики Ph-негативных патологий.
ИП, ЭТ и ПМФ являются разными представителями миелопролиферативных заболеваний, однако имеют общие подходы в патогенезе и диагностике. Для всех трёх патологий характерно наличие мутации в гене Янус-киназы 2, или JAK2V617F. Эта аномалия связана с дефектом 9-й хромосомы, где происходит замена аминокислот в положении 617 (полиморфизм Val617Phe).
В норме ген JAK2 кодирует белок-фермент JAK2, который передает сигналы от рецепторов к ядру кроветворных клеток, тем самым участвуя в их жизнедеятельности (рост, развитие и пр.). При мутации JAK2V617F рост кроветворных клеток становится бесконтрольным, что приводит к развитию новообразования. Чаще всего (96 %) мутация в гене Янус-киназы 2 встречается у пациентов с истинной полицитемией и в 55-60 % случаев у больных с эссенциальной тромбоцитемий и первичным миелофиброзом.
Прикладное значение определения генетической аномалии JAK2V617F связано с тем, что пациенты с данной мутацией могут получать таргетную — прицельную — терапию в виде препаратов из группы ингибиторов Янус-киназ. Эти лекарственные средства точечно воздействуют на мутацию, что ассоциировано с нивелированием серьезных побочных эффектов.
На основании результатов количественного анализа JAK2V617F лечащий врач может оценить динамику минимально остаточной болезни и эффективность предшествующего лечения.
Мутация jak2 v617f 17 аллельная нагрузка что это значит
Тест на выявление мутаций в гене JAK2 включен в клинические рекомендации ВОЗ в качестве одного из основных диагностических критериев хронических миелоидных опухолей. Вместе с тем, распространенность мутации V617F JAK2 среди добровольцев, не имеющих онкогематологического заболевания, составляет от 0,15 до 1,2%. При этом отсутствуют сведения об эффективности молекулярно-генетических скрининговых исследований для выявления мутации V617F JAK2 при тестировании пулированных образцов. Цель работы — сравнение результатов анализа мутации V617F JAK2, полученных при использовании разработанного метода и коммерческих наборов российских производителей, а также демонстрация возможности использования разработанной методики для анализа указанной мутации в пулированных образцах венозной крови. Материалы и методы. С целью выявление мутации V617F в гене JAK2 использовали разработанный в нашей лаборатории набор реактивов для метода аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Результаты. Продемонстрирована возможность проведения скрининга в пулированных образцах венозной крови. Показана высокая корреляция (R2 от 0,86 до 0,94) результатов количественного определения аллельной нагрузки V617F JAK2 с результатами, полученными в тех же пробах при использовании коммерческих наборов для ПЦР-РВ производства ООО «НПК Синтол» и ООО «ГеноТехнология», а также с результатами теста количественного пиросеквенирования фирмы «Интерлабсервис». Среди 485 «неинтерпретируемых» или «отрицательных» в тест-системе ООО «НПФ Литех» результатов тестирования 44 были положительными при использовании альтернативных наборов. При этом уровень аллельной нагрузки V617F JAK2 в этих пробах находился в пределах клинической значимости от 0,24 до 40,4% (Ме =9,6%). Выводы. Предел аналитической чувствительности (0,06%) и близкая к 100% (р
Выявленная в 2005 г. [9] соматическая мутация V617 °F в гене янус-киназы 2 (JAK2) приводит к активации JAK-STAT сигнального пути независимо от его физиологической рецепторной регуляции. Обусловленная данной мутацией пролиферативная активность миелоидного ростка кроветворения играет важную роль в патогенезе хронических Ph-негативных миелоидных опухолей. Тест на выявление мутаций гена JAK2 с 2008 г. включен в клинические рекомендации ВОЗ в качестве одного из основных диагностических критериев [18]. Одновременно было продемонстрировано, что распространенность мутации V617 °F JAK2 среди большой выборки добровольцев, не имеющих онкогематологического заболевания, составляет от 0,15 до 1,2% [10, 13, 21], что значительно превышает официально регистрируемую заболеваемость населения хроническими миелоидными опухолями (0,002—0,02%) [19]. Показано, что носительство мутации V617 °F JAK2 приводит к независимой от уровня циркулирующих клеток крови активации тромбоцитов [4] и значительно увеличивает риск как артериальных, так и венозных тромбозов [15]. Кроме того, мутация V617 °F JAK2 выявляется при тромбозах сосудов головного мозга в 3,8—6,6% случаев [7, 14], тромбозах висцеральных вен кишечника около 16% и до 40% случаев при синдроме Budd-Chiari [16, 20]. В связи с этими данными предполагается, что большинство пациентов с мутацией V617 °F JAK2 не доживают до развернутой картины гематологического диагноза и обсуждается вопрос о целесообразности проведения скрининга для раннего выявления этой мутации.
В Российской Федерации на декабрь 2015 г. из трех представленных на рынке наборов для выявления данной мутации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве изделия медицинского назначения зарегистрирована только одна диагностическая тест-система Jak2V617F-тест производства ООО «ГеноТехнология» [2]. «Комплект реагентов для выявления полиморфизма V617 °F в гене JAK2» производства ООО «НПФ Литех» имеет Подтверждение соответствия технической документации требованиям директивы 98/79/ЕС (http://www.lytech.ru/license.htm). Коммерчески доступен также «Набор реагентов для определения мутации V617 °F гена JAK2» ООО «НПК Синтол». При этом отсутствуют сведения о возможности использования этих наборов для скринингового исследования V617 °F JAK2 в пулированных образцах. Одним из основных требований к работе с пулами является достаточный порог аналитической чувствительности теста в присутствии избытка не имеющей искомой мутации ДНК, собранной от разных пациентов. В международной практике существуют процедуры регламентации допуска к клиническому использованию наборов реактивов для молекулярно-генетической диагностики, приготовленных непосредственно в лаборатории — «in house» методы [17].
Целью настоящей работы явилось сравнение результатов анализа мутации V617 °F JAK2, полученных при использовании разработанного метода и коммерческих наборов российских производителей, а также демонстрация возможности использования разработанной методики для анализа указанной мутации в пулированных образцах венозной крови.
Материалы и методы
При разработке метода учитывались рекомендации по детекции мутации V617 °F JAK2 [5]. С целью выявления мутации V617 °F JAK2 использовали собранный в нашей лаборатории набор реактивов для метода аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Использовались праймеры, указанные в работе [15]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала праймеры в концентрации 0,3 мМ, зонд 0,2 нМ (ООО «ДНК-синтез»), 2 мМ MgCl2 (ООО «НПК Синтол»), 0,25 мМ дНТФ (ООО «НПК Синтол»), 1xTaq буфер для амплификации (ООО «НПК Синтол») и 1 ед. активности Syn Taq-полимеразы (ООО «НПК Синтол»). Программа амплификации: активация фермента — 10 мин 95 °C, 50 циклов: денатурация — 95 °C 15 с, отжиг/элонгация — 60 °C 60 с. Количество вносимой ДНК — 40—60 нг.
Указанные в работах [1, 11] специфические праймеры заказывали в OOO «ДНК-Синтез», остальные компоненты реакционной смеси и ДНК-полимеразу — в ООО «НПК Синтол». Реакция была оптимизирована для выполнения анализа на амплификаторе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США). Пороговый выход кривых амплификации ПЦР-РВ (Сq) определяли методом Cy0 [8]. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с использованием реагента «ДНК-экспресс-кровь» (ООО «НПФ Литех»), а также с использованием набора «ДНК-Сорб-В» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). Концентрацию ДНК в образцах, полученных при выделении набором «ДНК-Сорб-В», измеряли с использованием набора «dsDNA HS Assay Kit» на флюориметре Qubit («Invitrogen», США).
С целью определения сравнительных характеристик чувствительности и специфичности тестирования были использованы образцы 886 проб венозной крови (из них 308 с мутацией V617 °F JAK2) от пациентов, направленных врачами-гематологами в период с 2012 по 2015 г. для обследования в лабораторию Красноярского филиала ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России в связи с подозрением на хронические миелоидные опухоли. Все образцы ранее были протестированы на наличие мутации V617 °F JAK2 с использованием наборов ООО «НПФ Литех». Из всех выбранных образцов 35 были исследованы дополнительно с использованием наборов ООО «НПК Синтол», 25 — с использованием наборов ООО «ГеноТехнология» и 45 — в реакции пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) с использованием набора реагентов «АмплиСенс Пироскрин», «Тромбо-скрин» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии») в количественной модификации [2].
С целью отработки методики тестирования пулированных образцов в исследование включили 1323 анонимных пробы венозной крови пациентов КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» и НУЗ «Дорожная клиническая больница ст. Красноярск ОАО «РЖД», собранных в период с июня по декабрь 2015 г. Процедуру пулирования проводили после выполнения гематологического исследования на анализаторе Sysmex XT-2000i (Япония) для обеспечения равного соотношения ядросодержащих клеток в приготовленном пуле. Каждый пул включал 7 отдельных образцов крови пациентов.
Для проведения статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0. Описательная статистика представлена в виде значений медианы (Ме). Для оценки корреляционных связей использовали непараметрический метод Спирмена.
Результаты и обсуждение
Для оценки предела аналитической чувствительности молекулярно-генетического теста принято использовать подходы, основанные на выявлении искомой мутации при последовательном разведении стандартных образцов с известным и гарантированным количественным уровнем соотношения дикого и мутантных аллелей. В качестве таких образцов могут выступать охарактеризованные в референс-лабораториях клинические образцы или клеточные культуры с известным уровнем аллельной нагрузки [1, 3, 5]. При этом важным требованием к среде для разведения образцов является присутствие в ее составе соответствующего количества ДНК с «диким» аллелем для учета чувствительности теста к показателю соотношения аллелей в условиях существенного избытка молекул ДНК без искомой мутации. Стандарты, основанные на образцах ДНК, полученных из культур клеток, также требуют систематического контроля реальных значений аллельной нагрузки, поскольку даже в стандартных условиях культивирования in vitro существует риск утраты стабильности клона [6].
Весьма распространенным вариантом оценки порога чувствительности тест-систем является метод разведения специфических «ДНК-векторов», содержащих мутацию, однако данный подход также не является идеальным, поскольку сопряжен с потерей фактора влияния на эффективность ПЦР полногеномной ДНК.
Еще одним способом оценки порога чувствительности может являться описанный A. Bench и C. Martinaud [5, 12] метод, основанный на определении параметров накопления флюоресцентного сигнала в пробах с заведомым отсутствием искомой мутации в связи с образованием неспецифического продукта амплификации на поздних стадиях ПЦР. Полученные таким образом значения расчетной аллельной нагрузки позволяют определить вероятность получения ложнопозитивного результата при заданном пределе аналитической чувствительности метода.
С целью определения уровня выхода неспецифического сигнала при амплификации мутантного аллеля в нашей версии «in house» теста было исследовано 589 проб венозной крови с ничтожно малой вероятностью обнаружения данной мутации. В данную группу были включены пробы 18 здоровых студентов-добровольцев моложе 25 лет, а также пациенты без клинического подтверждения диагноза и с отсутствием мутации при тестировании коммерческими тест-системами. По полученным значениям разницы пороговых циклов (Cq) дикого и мутантного аллелей в реакции ПЦР-РВ этих проб рассчитывали уровень предполагаемой аллельной нагрузки по формуле:
где Cqдик — пороговый цикл дикого аллеля, Cqмут — пороговый цикл мутантного аллеля.
В соответствии с полученными данными (рис. 1) для проб с заведомо отрицательным результатом, гарантирующим их попадание в область отрицательных значений с вероятностью 99,999% (6σ), граница предела уверенного определения аллельной нагрузки находится на уровне 0,06%, что соответствует вероятности ложноположительного результата в 0,00034% случаев.
Рис. 1. Расчетная аллельная нагрузка (в %) по результатам тестирования 589 проб с отсутствием мутации V617 °F JAK2. Указана граница между положительными и отрицательными (неспецифический сигнал) результатами на уровне 6σ (0,06%).
В качестве контроля количественного теста были использованы пробы пациентов, исследованные ранее в референсной лаборатории доктора A. Vannucchi (Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Италия), которые позволили убедиться в совпадении результата с результатами, полученными в методе «in house».
Способ выделения ДНК не оказывал существенного влияния на результат тестирования набором «in house», коэффициент корреляции результатов определения аллельной нагрузки в образцах ДНК, выделенных с использованием реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» или набора «ДНК-сорб-B» («АмплиПрайм»), составил 0,96 (p 
Рис. 2. Результаты определения уровня аллельной нагрузки V617 °F JAK2 (в %) набором «in house» в зависимости от используемого способа выделения ДНК.
Результаты тестирования проб венозной крови «in house» методом аллель-специфической ПЦР-РВ продемонстрировали высокую достоверную корреляцию по сравнению с результатами, полученными при тестировании данных проб с использованием коммерческих ПЦР тест-систем ООО «ГеноТехнология» и ООО «НПК Синтол», а также методом количественного пиросеквенирования (рис. 3).
Рис. 3. Корреляция результатов определения аллельной нагрузки (в %) в пробах венозной крови методом «in house» c результатами их тестирования с использованием коммерческих наборов (а, б, в).
Вместе с тем результаты тестирования проб набором «in house» в сравнении с результатами, полученными при параллельном тестировании проб с использованием коммерческой тест-системы ООО «НПФ Литех», выявили существенное расхождение (см. таблицу).
Результаты тестирования проб методом «in house», ранее исследованных с использованием набора ООО «НПФ Литех»
Из таблицы следует, что если при интерпретации результатов тестирования строго придерживаться инструкции производителя набора ООО «НПФ Литех», то 44 (47,3%) из 93 положительных проб будут расценены как отрицательные или неинтерпретируемые. При этом уровень аллельной нагрузки V617 °F JAK2 находился в пределах от 0,07 до 29,9%, (Ме =8,2%) в группе неинтерпретируемого результата и от 0,06 до 2,0%, (Ме =0,26%) в группе отрицательного результата. Одной из причин выявленного расхождения следует считать ошибочно используемый в инструкции к набору ООО «НПФ Литех» подход к оценке аллельной нагрузки соматической мутации как к результату определения генетического полиморфизма «гомозиготность—гетерозиготность».
Ввиду высокой аналитической чувствительности теста, достаточной для выявления клинически значимых уровней аллельной нагрузки данной соматической мутации (1—3%) [5, 13] даже в многократно разведенных «диким» аллелем ДНК пробах, было проведено скрининговое исследование, направленное на оценку распространенности мутации среди пациентов медицинских учреждений, не имеющих на момент обследования онкогематологического заболевания. В результате данной работы было проведено исследование 1323 предварительно пулированных образцов венозной крови. Были выявлены 8 пулов с положительными результатами (уровень аллельной нагрузки выше 0,06%). При последующем тестировании проб, входящих в данные пулы, были выявлены 11 образцов с уровнями аллельной нагрузки от 0,24 до 40,4%. При контрольном исследовании 49 проб, входящих в 7 отрицательных пулов, не выявлено ни одной пробы с данной мутацией, что подтверждает достаточную чувствительность и специфичность «in house» теста в рамках используемого протокола пулирования образцов.
Заключение
Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрирована высокая корреляция результатов использования «in house» метода аллель-специфической ПЦР-РВ для определения мутации V617 °F JAK2 с основными коммерческими тест-системами количественной ПЦР российского производства, а также возможность использования разработанной диагностической тест-системы для тестирования в пулах образцов венозной крови при проведении скрининговых исследований.
Авторы выражают признательность студентам Сибирского федерального университета, оказавшим помощь в проведении данного исследования и ставшим донорами крови, руководству и сотрудникам КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» и НУЗ «Дорожная клиническая больница ст. Красноярск ОАО «РЖД» за предоставленные пробы крови пациентов, а также профессору A. Vannucchi (Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Италия) за проведение подтверждающих тестов в референс-лаборатории.
Конфликт интересов отсутствует.
Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ СО РАН и СФУ, фонд инноваций общественной организации «МедЛабДиагност».